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동물실험

Tail DNA isolation

Tail lysis buffer ; 50mM Tris-Cl(pH8.0), 100mM EDTA, 100mM NaCl, 1% SDS

(SDS 제외하고 나머지 섞어서 autoclave 한 후 SDS 첨가)

1. Lysis buffer 450㎕에 tail 0.5cm 정도와 nail 발톱위부분까지 잘라 protenase K (10mg/ml) 25㎕를 더한다.

2. 55℃에서 8시간 - overnight으로 incubation (rocking으로 하는 것이 좋다)

3. Saturated NaCl 160㎕를 더하여 약 15초간 vigorously하게 shaking 한다.
(protein이 salting out 되어 나중에 spin하고 나면 SDS와 함께 흰 침전으로 떨어진다)

4. 12,000rpm에서 15분-20분 centrifuge한다.

5. Pellet이 따라오지 않도록 supernatant를 fresh tube로 옮긴다.

6. 상등액과 동량의 (약 500㎕정도) isopropanol을 넣고 up & down 하면서 DNA를 precipitation 시킨다.

7. 12,000rpm, 10min centrifuge 한다.

8. 70% ethanol 약 1ml로 washing을 두번 한다.

9. 1.5ml tube 뚜껑을 열어 실온에서 10분 이상 dry 시키고, D.W 30 - 50㎕로 녹인다.

Genomic Southem Blotting

1. DNA를 적당한 enzyme으로 cutting : DNA는 10ug/lane 이상으로 running 한다.

2. Gel 만들기 : 0.8% agarose gel + EtBr

    3. Gel running : 1volt/cm
       보통 30 - 50volt로 running한다. DNA size marker도 꼭 같이 running.
       Dye가 약 2/3 정도 내려갔을 때 사진을 찍는다.
       DNA size marker 옆에 cm를 확인할 수 있는 자를 놓고 함께 찍는다.

4. <option> 0.2N HCl로 depurination.
Purine기를 끊어서 transfer가 잘되도록 한다. 이 과정은 보통 15kb 이상의 큰 DNA를 detect 할 때 사용한다.

5. Gel denaturation. 45min, agitation
Denaturation은 장시간 하면 좋을게 없으므로 길어도 한시간을 넘지 않도록 denaturation이 끝나면 neutralization 하기

전에, 강염기가 씻기도록 D.W로 몇 번 헹구어 낸다.

* Denaturation sol. 조성 ; 0.5N NaOH, 1.5M NaCl
NaCl 876.6g, NaOH 200.0g / 10 liters

6. Neutralization. 2시간.
Neutrailization 시간이 너무 짧으면 나중에 membrane washing이 안되어 background가 될 수 있으므로 충분히 시간을

둔다. o/n 해도 무방하다.

        * neutralization sol. 조성 ;
           Trisma base 242.2g, NaCl 350.7g / 2 liters
          Trisma base 1211.0g, NaCl 1753.5g / 10 liters
           HCl로 pH를 7.0으로 조절 & autoclave 하여 4℃ 보관

7. Transfer

        - 3M paper (gel 크기와 같게 두 장) ; D.W에 충분히 soaking.
        - Membrane (gel 크기와 같게 혹은 약간 작게) ;
           Hybond N+ (Amersham, RPN303B) 2X SSC에 충분히 soaking.

        - 보통의 경우에 transfer buffer를 20X SSC를 사용하지만, 2X SSC 만으로도 transfer는 충분히 되고,
          강한 salt는 오히려 background로 남아있을 수 있다.
        - Gel 위에 올려놓는 weight는 시약 카달로그 만한 무게면 충분하다.
        - Transfer overnight

8. Prehybridization & hybridization

- Prehybridization sol.; Hybrisol I (INTERGEN, S4040)
- Prehybridization은 42 - 45℃에서 한시간 이상, membrane이 작으면 5ml정도, 크면 10ml 정도로 사용한다.

           - 1ml 주사기의 피스톤을 뽑아내고, 주사기 끝을 솜으로 막는다.
           - 주사기를 15ml tube에 받치고, sephadex G-50을 흘려 넣는다.
           - 3000 rpm, 5min centrifuge한다.
           - 빠져나온 물 버린다.
           - Labeled DNA + D.W 100㎕, 3000rpm 5min, centrifuge 한다.
           - 이 과정이 끝난 후 probe는, 4.0 * 106 cpm 정도 되게 한다.
           - 95℃ 10min denaturation & on ice 잠깐 둔다.
           - Labeled DNA를 prehybri sol.에 그대로 넣어주고, overnight 한다.

9. Wash

        washing sol.I ; 2X SSC, 0.5% SDS
        washing sol.II ; 2X SSC, 0.1% SDS
       washing sol.III ; 0.1X SSC, 0.1% SDS

         - washing sol.I ; 65℃ 5 - 10min
         - washing sol.II ; 실온에서 15min 이상, cpm 측정을 해보면서..
         - washing sol.II ; 65℃ 30min , cpm 값이 2.0 * 103 안쪽으로 떨어질 때까지
         - washing이 끝난 membrane은 3M paper 위에서 물기만 없어질 정도로 말린후 OHP film으로 덮거나 랩으로 싼다.

10. Expose to X-ray film : 카세트의 intensifying screen 쪽에 film을 놓고, 맞대어서 membrane을 넣는다.

11. Development

         - Develop sol. ; detection 되는 것을 확인해 가면서 1 - 5min
         - D.W로 develop sol. 헹구어 낸다.
         - Fixation ; 2 - 3min.
         - Film을 실험실로 가져와 마지막으로 D.W로 한 번 더 헹구어 낸다.

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