Embryonic stem cell(129/SvJ-SvEv)로부터 만들어진 genomic DNA library을 이용하여 targeting 벡터를 제조할 유전자를 검색한다. 유전자 검색을 위해 배지는 LB agar(10g Bacto-tryptone, 5g yeast extract, 10 NaCl, 15, Bacto-agar/ℓ)를 45분간 고압증기 멸균 후 plate에 부어 굳힌 후 냉장고에 보관한다. 다음날, 냉장고에 있던 plate를 상온으로 옮긴 후 clean bench에서 수분을 제거한다.
Lambda phage의 숙주인 세균(XL1blue-MRA-P2)은 10mM MgSO4 및 0.2%Maltose를 첨가한 LB 배지에 접종하여 30℃에서 밤새 배양 한다. 적당하게 배양한 세균을 사용 전까지 4℃에 옮겨 둔다. 배양한 세균을 OD600을 측정한 후 원심분리(5000g, 10분)한 후 상층액을 버리고, 10mM MgSO4로 OD600이 0.5가 되게 부유시킨다. First screening시에는 세균 부유액 2ml에 박테리오파지 2×105을 넣어준 후 37℃에서 15분간 배양하여 둔다. 전체 6 plates(21×21cm)를 준비하여 1.2×106개의 plaques를 검색한다.
세균과 박테리오파지 배양액을 준비된 50ml의 LB-Top agar(10g NaCl, 10g tryptone, 5g yeast extract. 7.5g agarose/ℓ-52℃)에 잘 섞은 후 각각의 plate에 골고 루 부어준다. Top-agar가 잘 굳었는지 확인한 후에 37℃ 배양기에서 8-9시간동안 배양한다. Plaques가 나왔는지 확인한 후, plate를 배양기에서 꺼낸 후 4℃에 보관한다. 나일론 membrane을 증류수로 세척한 후 1M NaCl 용액에 담가 적셨다가 물기가 남지 않도록 잠깐 말린 후, 재빨 리 위의 plate위에 놓은 후 인디고 잉크로 16회 정도 표시를 한 다음 5분 동안 방치한다.
Membrane을 denaturation 용액(8g NaOH, 87.6g NaCl/ℓ)에 5분 동안 두어서 DNA가 변성되게 한다. 이것을 다시 중화 용액(121g Trisma base, 175.3g NaCl/ℓ (pH 7.0))에 5분 동안 두어 중화시킨다. Membrane을 적당히 건조시킨 후 적어도 68℃에서 1시간 이상 고정시킨다. 이 membrane을 증류수로 적신 후, 이것을 다시 hybridization 용액(6X SSC [0.9M NaCl, 0.09M Sodium citrate], 0.5% SDS, 0.02% BSA, 0.02% Ficoll, 0.02% PVP)에 옮겨 68℃에서 2시간 동안 prehybridization 시킨다.
여기에 위에서 제조된 probe를 넣어 준 후 68℃에서 16시간 이상 hybidization 반응을 시킨다. 반응 후 3X SSC/ 0.5% SDS 용액으로 68℃에서 30분간 세척한 후 이를 다시 1X SSC/0.167% SDS로 68℃에서 30분간 세척하고 용액 을 다시 0.6X SSC/0.1% SDS 용액으로 갈아 준 후 Guyger counter를 이용하여 세척 정도를 모니터링한다. 세척이 끝나면 membrane을 건조시킨 후 X-ray film에 -70℃에서 12시간 이상 노출시킨다. 동위원소로 감광된 film을 현상 한다. 이렇게 하여 얻어진 plaques를 2차, 3차 검색과정을 통해 clone을 얻는다.

 2. 제한효소지도 작성

유전자 검색을 통해 얻어진 clone을 BamHⅠ, EcoRⅠ,HindⅢ, Not I, XbaⅠ, 그리고 XhoⅠ등의 제한효소로 잘라 1% agarose gel에서 전기영동한다. 또한 이 gel을 이용하여 얻고자하는 유전자의 확인과 위치를 파악을 위해 southern blot 분석을 수행한다.
southern blot 분석을 위해, gel을 denaturation 용액(20g NaOH, 87.6g NaCl/ℓ)에 25분동안 두어서 DNA가 denaturation되게 한다. 이것을 다시 중화 용액(121g Trisma base, 175.3g NaCl/ℓ,pH 7.0)에 25분 동안 두어 중화 시킨다. gel의 DNA을 20X SSC용액(3M NaCl, 0.3M sodium citrate pH7.0)과 모세관 현상을 이용하여 나일론 membrane에 transfer하고 적당히 건조시킨 후 적어도 68℃에서 1시간 이상 고정 시킨다.
이 membrane을 증류수로 적신 후, 이것을 다시 hybridization 용액(6X SSC [0.9M NaCl, 0.09M Sodium citrate], 0.5% SDS, 0.02% BSA, 0.02% Ficoll, 0.02% PVP)에 옮겨 68℃에서 2시간 동안 prehybridization 시킨다. 여기에 위와 같은 방법으로 제조된 probe를 넣어 준 후 68℃에서 16시간 이상 hybridization 반응을 시킨다.
반응 후 3X SSC/0.5% SDS 용액으로 68℃에서 30분간 세척한 후 이를 다시 1X SSC/0.167% SDS로 68℃에서 30분 간 세척하고 용액을 다시 0.6X SSC/0.1% SDS 용액으로 갈아 준 후 Guyger counter를 이용하여 세척 정도를 모니터링한다. 세척이 끝나면 membrane을 건조시킨 후 X-ray film에 -70℃에서 12시간 이상 노출시킨 후 film을 현상 한다. 이렇게 얻어진 정보를 통하여 유전자 지도를 작성한다.

 3. Targeting 벡터 제조

위에서 작성된 제한요소지도에 따라, 결실시킬 유전자에 한 쪽 말단은 4-6kb, 다른 한 쪽은 약 1kb 정도가 되게 자른 후, agarose gel에 전기영동하여 QIAEX II Gel Extraction Kit(QIAGEN)을 이용하여 gel로부터 DNA을 얻어 이것을 pBluescript 벡터에 T4 DNA ligase을 이용하여 subcloning한다.
subclonig된 유전자을 competant 세포(DH5-alpa)에 형질전환시켜 배양한다. 이렇게하여 증식되어 얻어진 유전자를 pBluscript 벡터 내 multi clonig site를 이용하여, targeting 벡터 안의 cloning해야할 위치의 제한효소에 맞도록 자른 후, 위에서 사용한 것과 동일한 방법으로 targeting벡터에 cloning 한다.

 4. ES cell transfection

  ㆍFeeder cell 준비

      Embryonic feeder cell은 ES cell을 배양하기 위해 필요한 세포로서 G418-resistant한 mouse에서 분리한 fibroblast를

      feeder cell로 사용한다.

    
    ① 마우스를 교배시킨 후 다음날 질전유무를 체크한 후 질전이 확인된 마우스를 분리하여 13-14일간 둔다.
    ② 13-14일이 되면 마우스를 희생 후 개복하여 uterus만 분리하여 PBS로 옮긴다. 이 후 작업은 클린벤치
        에서 실시한다. Uterus를 PBS로 몇 번 washing한 후 dish로 옮겨 자궁벽으로부터 fetus만 분리해낸다.
    ③ 머리부분을 절단하고 붉은장기(간,심장)를 제거한 후 PBS가 담겨진 새로운 dish로 옮겨 washing한다.
    ④ 1x trypsin/EDTA가 담긴 dish로 fetus를 옮긴 후 잘게 잘라준 후 삼각플라스크로 옮겨준다.
        37℃ shaking incubator에서 30분간 둔 후 상층액만 걷어 원심분리 후 dish에 깔아준다.
    ⑤ 분리한 세포는 계대배양하여 원하는 수만큼 얻어지면 γ-irradiation(3000 rad)을 하거나 mitomycin C를
       처리한 후 plating한다.