형질전환 동물(Transgenic mouse)을 개발하기 위한 방법으로,mouse 수정란(embryo pronucleus)의
웅성 전핵에 DNA를 주입하는 기술로써, 제작한 DNA를 동물에 발현 시켜 형질전환을 야기시키는 방법이다.
1. 외래유전자의 준비
미세 주입할 DNA에 사용되는 시료 및 기구는 모두 멸균하여 사용한다. 재조합 DNA를 제한 효소로 절단하여
linear형태로 만든 다음, 0.7-1% agarose gel에서 전기영동을 실시한 후 필요로 하는 DNA 절편을 electroelution
방법으로 회수한다. 회수된 DNA를 1/2 volume의 phenol과 1/2 volume의 CIAA로 섞어주고 30초간 vortex 해준
후, 12,000 rpm에서 3분간 원심 분리한 다음, DNA가 용해되어 있는 상층액을 회수한다. 이러한 phenol 추출법을
3회 실시 후 에탄올로 DNA를 침전시켜 순수한 DNA를 회수한다. 이때 회수된 DNA가 2-10㎍ 정도가 되면 미세
주입 실험에 충분한 양이 된다. 순수 분리한 DNA를 농도가 2-4ng/㎕가 되도록 미세주입용 용액 (10mM Tris·HCl,
0.1mM EDTA, pH 7.4)으로 조정한 다음, DNA용액을 각각의 1.5ml eppendorf tube에 50㎕씩 분주하여 -20℃에
저장해 두고 사용한다.
2. 실험동물
수정란 공여 및 대리모를 위한 동물로는 수정란공여 마우스는 3-4주 령의 것을, 대리모용 마우스는 6-8주의 마우
스를 실험에 사용한다. 사육조건은 SPF(Specific Pathogen Free)이며, 조명은 12시간씩 dark/light cycle이다.
사료는 무제한 급여하며, 물도 무제한으로 급여한다.
3. 수정란의 준비
다배란 유기를 위하여 PMSG(Prenant Mares Serum Gonadotropin ; Serotropin, Japan)와 HCG (Human
Chorionic Gonadotropin : Sigma, USA)를 48시간 간격으로 각각 5 IU씩 교잡종 자성생쥐의 복강 내에 주사한
다음, 동일계통의 웅성생쥐와 1:2로 합사시켜 자연교미를 유도한다. 다음날 아침, 질전의 유무를 확인하여 질전이
있는 개체만을 골라서 경추탈구법 (cervical dislocaton method)으로 도살한 다음 난관을 절취한다. 절취된 난관
의 팽대부를 주사바늘로 터트려 난구 세포괴(cumulus cell mass)를 회수하며, 회수된 난구 세포괴를 300 unit/ml
의 hyaluronidase (Sigma, USA) 용액에 2-3분 처리한 후 15,000 rpm으로 약 3분간 원심처리 함으로 핵막의 관찰
을 용이하게 한다.
ㆍHormon injection/ mating
<과배란 유기 (Hormon injection)>
- PMSG(pregnant mare serum gonadotropin ; 임마혈청성 생식선자극 호르몬)
- hCG(human chorionic gonadotropin ; 임부태반융모성 생식선자극 호르몬)
<처리방법 및 과정>
- PMSG injection > 48시간후 > hCG injection > male와 합사
ㆍPlug check(질전 유무확인)
Female mouse의 생식기에 유백색(황색,백색)의 질전 형성확인
ㆍOviduct 적출 및 Flushing
1) 안락사에 의한 mouse의 Oviduct 적출
mouse의 두개골과 경추 골이 연결부위를 손가락 또는 도구를 이용하여 경추골과 두개골을 이격시켜
경부의 신경을 모두 절단 되게 하여 동물이 고통을 못 느끼게 하여야 한다.
2) Mouse의 Oviduct 적출
DNA injection에 필요한 수정란은 1Cell상태의 수정란이어야 한다. 1Cell상태의 수정란은 mouse의
자성생식 기관의 난관(난관 팽대부)에 위치하며, 배란이 되어 8 ~ 10시간이 경과된 시기이며 그 방법은
다음의 그림과 같이 안락사후 개복을 실시 하고, 자성생식기관의 위치를 확인 한다.
자성생식기관을 확인 후 생식기의 난관부분을 적출해낸다. 이때 난관의 팽대부가 손상되지 않게 주의해야 한다.
3) 수정란 회수(Flushing)방법
수정란의 회수 방법은 주사침을 이용하여 난관 팽대부를 절개하여 수정란을 회수하는 방법과 관류액을
이용하여 수정란을 관류하는 두 방법이 있고, 회수방법은 다음그림과 같다.
아래 그림과 같이 용기에 배양액 방울을 만들어 그 안에 수정란을 넣은 후 oil로 덮어 Co2 배양기에 배양한다
4. 재조합 유전자의 미세 주입
외래 유전자의 미세주입은 미세조작기(micromanipulator : Leitz, Germany)를 이용하여 수정란의 웅성 전핵에
주입하였는데, 이때 핵막의 용이한 관찰과 실험의 편리함을 도모하기 위하여 DIC system을 갖춘 도립현미경
하에서 실험을 수행한다. 외래유전자가 핵 내에 주입되는지의 여부는 웅성전핵의 팽창(swelling)으로 확인한다.
ㆍPipette 제작 및 micromanipulator secting
Micromanipulator의 구조
ㆍPipette 제작 방법
- Pipette제작시 사용 되는 기기
· Puller : micropipette을 길고 가늘게 늘여 주는 기계장치
· Poger : 길게 늘 여진 pipette를 injection할 수 있는 상태로 가공 하는 기계장치
- Puller에 micropipette을 장착 한 후 길게 늘여 준다.
- Poger를 사용하여 injection을 할 수 있게 자르거나 구부리는 등의 가공과정을 거쳐 pipette를 제작한다
- Pipette제작시 고려사항
· pipette는 가늘고 정교하게 제작되어야 하고, 수정란에 상처를 주지 말아야 하며, 제작 시 이물질이 묻어서는 안된다.
· pipette는 수정란의 상태에 따라 당일에 제작하여 사용하는 것 이 유리하다.
- pipette의 제작방법은 다음 그림과 같다.
ㆍMicromanipulator(미세조작 현미경) secting
Micromanipulator(미세조작 현미경)에 pipette 장착방법
- injection pipette와 holding pipette은 수평상태로 장착 되어야 한다.
- pipette의 각도는 서로 같아야 한다.
ㆍDNA injection
<수정란 관찰 및 DNA주입시기>
Injection을 하기 앞서서 수정란의 상태를 관찰하여 injection의 시기를 결정하여야 하는데, 수정란은 1세포기에서 2세포기로
발달하는 시간이 짧기 때문에 시기를 지나처서는 안된다. 또한 이 시기의 결정여부에 따라 T/g로의 발현 여부가 결정이 된다.
아래의 그림은 수정란의 시간경과 별 발달과정을 나타낸 그림으로 수정 후 수정란의 발생과정을 잘 관찰하고 판단을 하여,
injection시기 결정 할 수 있다.
ㆍDNA injection 방법
Injection시기가 결정되면 준비된 Micromanipulator에서 수정란을 골라 극도로 팽창되어진 두개의 전핵중
웅 성전핵에 일정량의 DNA를 주입하게 된다. 이때 수정란은 손상을 가장 적게하는 것이 중요하다.
5. Embryo Transfer용 대리모 준비
자연적인 상태에서 발정기(estrus cycle)를 나타내는 ICR 계통의 자성생쥐를 수정란 채취 하루전에 교미를 시키는
데, 이때 사용되는 웅성생쥐는 정관수술을 실시한 생쥐이며, 적어도 3일 이상 교미를 하지 않은 상태의 수놈을
사용하여 1:2로 교미를 시키며, 다음 날 아침 자성 생쥐의 질전의 유무(vaginal smear)를 확인하여 교미가
이루어진(pluged) 자성 생쥐를 대리모로 사용한다.
ㆍ정관 결찰 수술
대리모를 만들기 위해 mating에 사용되는 male은 반드시 정관 결찰 수술을 실시한 동물을 사용하며, 정관 결찰 수술에 사용 되
는 동물은 6주령 이상의 성성숙이 완료된 동물이어야 한다.
<정관 결찰 수술 방법>
정관 결찰 수술은 그림A와 같이 마우스의 복부를 절개하여 웅성생식 기관을 외부로 돌출 시킨 후 그림B,C의 그림과 같이
정관의 일부분을 절단 시킨 후사용한다.
6. 수정란이식(Oviduct Embryo Transfer)
외래유전자가 주입된 수정란들은 CO2 배양기 내에서 배양한 후 1세포기(1cell) 또는 2세포기(2cell)의 건강한
상태의 수정란을 선별하여 이식한다. 먼저 마취제(Avertin)를 생쥐 체중의 10g당 0.5mg의 양으로 복강내에 주사
(IP)하여 전신 마취를 실시한다. 이때, 마취가 확실히 이루어지지 않았을 경우에는 0.1cc를 더 투여하는데,
대리모의 상태를 철저히 고려한 후 사용하여야 한다. 마취가 확실히 이루어지고 난 뒤, 가친의 배측 정중선을
약 1cm정도 절개하고 난소, 난관을 들어내어 각각의 난관에 수정란을 이식한 후 난관의 팽대부가 약간 부풀러
오른 것을 확인한다. 그 후 복강내에 난관과 난소를 다치지 않게 잘 넣고 근육층과 표피를 봉합한다.
ㆍ수정란이식 pipette제작 방법
수정란 이식에 사용되는 pipette은 아래의 그림과 같이 직경이 수정란 한 개 크기로 제작을 하며, 수정란을pipette에 넣어
수정란이식을 실행 한다
ㆍ수정란 이식
- 수정란 이식 : injection이 끝난 수정란은 1세포기 또는 2세포기에 이식을 한다. 이식을 하는 위치는 난관 부분에 불어
넣어주면 된다.
- 수정란 이식 시 대리모는 마취제(Avertin)로 마취를 시킨 후 배측의 일부분을 절개하여 자성생식기관을
외부로 돌출 시킨 후 수정란을 불어 넣은 후 봉합을 한다.
- 수정란 이식위치 : 돌출되어진 자성생식기관의 좌측 상단부분의 난소와 난관의 사이를 보면,
난관 팽대부 (infundibulum)가 보이 며 난관팽대부의 우측을 보면 나팔모양의 난관 끝부분이 보인다.
- 이식 : 나팔관 부분을 찿아낸 후 핀셋을 이용하여 난관막을 잡고 수정란이든 pipette으로 난관 막에
구멍을 내고 나팔관에 집어 넣은 후 수정란을 난관에 불어 넣으면 되고, 수정란을 불어넣은 후 꺼낸
역순으로 생식기관을 밀어 넣은 후 수술부위를 봉합한다.
* 수술을 마친 마우스는 체온이 급격히 떨어져있는 상태이기때문에 보온을 해 주어야 한다.
7. 산자의 유전자형 확인
대리모에서 태어난 산자의 외래유전자 발현여부는 삽입된 외래유전자에서 만든 PCR primer를 이용하여 실시한다. 산자의 꼬리를 약 0.5cm 정도 잘라내어 proteinase K 가 함유된 lysis buffer를 이용하여 genomic DNA를 추출하여 PCR을 실시하여 외래 유전자의 germline transmission 여부를 판별한다.
