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연구개요

산소를 이용하는 생명체에서는 대사과정 중 H2O2와 같은 활성산소(Reactive Oxygen Species, ROS)가 필연적으로 발생되고, UV, X-ray, 항암제 등과 같은 외적 요인과 식균작용 과정에서도 많은 활성산소가 발생되며. 또한 정상적인 생명현상인 세포의 성장과 사멸과정에서도 활성산소가 발생되어 세포신호전달을 매개한다고 알려져 있다 (그림1). 세포는 이러한 활성산소에 의한 oxidative damage를 막아내기 위한 항산화 방어체계를 갖고 있지만, 과량의 활성산소는 직접적으로 염색체, 단백질, 세포막 등의 변형을 유도하여 노화 및 다양한 질병 유발에 깊이 관여하고 있다 (그림1). 이와 같이 활성산소는 노화를 비롯한 다양한 질병(암, 당뇨, 심장질환, 뇌질환, 골질환 등)의 발생과 진행과정에서 중요한 역할을 하지만, 활성산소와 질병과의 관련성에 대한 연구는 초기 단계로, 많은 현상들이 분자적 수준에서 규명되기를 기다리고 있다. 질병유발과 관련된 신호전달에서 신호전달 물질로서 활성산소의 기능을 이해하기 위해 활성산소의 생성, 작용표적 및 제거와 관련된 기전연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구실에서는 세포신호전달과정에서 생성되는 활성산소의 작용표적 및 이들의 레독스 조절인자의 발굴과 조절기전, 이들에 의한 퇴행성 질환들의 제어기전을 규명함으로써 활성산소와 밀접한 연관이 있는 질환들의 치료를 위한 원천지식을 얻고자 주력하고 있다.

그림1. 세포 내 활성산소의 생성, 제거 및 작용표적

그림1. 세포 내 활성산소의 생성, 제거 및 작용표적

연구내용

다양한 수용체를 통한 세포신호전달 (receptor-mediated cell signaling)과정에서 H2O2와 같은 활성산소가 생성되고, 활성산소의 생성을 억제하거나 제거하면 신호전달이 저해된다는 많은 연구결과들은 활성산소가 신호전달과정을 매개하리라는 것을 시사한다. cAMP, IP3같은 신호전달물질과는 달리 H2O2는 단백질에 의해 특이적으로 인지되기에는 구조적으로 너무 단순하여 단백질에 가역적으로 결합하여 신호전달을 하기는 어렵고, 표적단백질의 가역적인 산화환원을 통해 신호전달을 매개할 것으로 여겨진다 (그림2). 표적단백질의 시스테인 잔기의thiol이 H2O2에 의해 sulfenic acid 나 disulfide로 산화되고, thioredoxin (Trx) 또는 TRP14 (Trx-related protein of 14 kDa)같은 다양한 환원효소에 의해 thiol로 환원되는 가역적 반응을 통해 표적단백질 활성이 조절됨으로써 신호전달에 관여할 수 있다. 예를 들어 H2O2는 Tyr 및 Ser/Thr phosphatases (PTP1B, PTEN, LMW-PTP, FAK, SHP and CDC25) 와 전사인자 (NF-κB, HIF-1α and AP-1)의 특정 시스테인 잔기의 산화를 통해 이들의 활성을 억제하고, 이들 중 일부는 Trx1이나 TRP14에 의해 환원됨으로써 활성이 회복된다고 알려져 있다.
그림2. Proposed cyclic on-off switch of ROS-mediated signaling

그림2. Proposed cyclic on-off switch of ROS-mediated signaling

세포신호전달의 레독스 조절기전 연구

활성산소는 표적단백질의 시스테인 산화를 통해 신호를 전달하고, 신호전달 후 산화된 시스테인 잔기는 단백질의 인산화와 탈인산화 과정과 같이 세포 내 환원시스템에 의해 가역적으로 원상복귀 됨으로써 신호전달을 매개할 것으로 여겨지고 있다 (그림2). 세포 내 대표적인 2가지 환원시스템은 glutathione reductase/glutathione(GSHR/GSH)과 thioredoxin reductase/thioredoxin(TrxR/Trx) 시스템이 있다. 그러나 다양한 신호전달에서 활성산소가 특이적인 신호전달을 매개하기 위해서는 신호전달과정에서 주요한 단백질변형으로 알려진 인산화/탈인산화에 특이적인 kinase/phosphatase가 관여하듯이 세포 내 특정위치에서 활성산소가 생성되어 특정 표적을 산화시킬 뿐만 아니라, 이들에 특이적으로 작용하는 환원효소들이 필요할 것으로 예상된다. 이러한 가설 하에 새로운 환원시스템을 탐색한 결과, Trx domain을 갖는 TRP14을 포함한 다수의 환원효소들이 발굴되었다.

 

활성산소 매개 신호전달에서 산화적 변형이 되는 활성산소 표적단백질은 다시 환원되어야 하므로, Trx나 TRP14같은 환원효소의 기질은 활성산소에 의해 민감하게 산화되는 표적단백질일 가능성이 매우 높다. 그러므로 Trx나 TRP14의 기질단백질의 탐색은 활성산소의 표적단백질도 찾아내는 일석이조의 전략이 된다. Trx는 포유류의 경우 세포질과 마이토콘드리아에 각각 Trx1과 Trx2가 존재하고, TRP14는 세포질에 존재한다. 이들은 산화환원 작용기전에 필요한 잘 보존된 활성부위(Trx1, C32GPC35; Trx2, C66GPC69; TRP14, C43PDC46)에 2개의 시스테인 잔기를 갖고 있다. 첫 번째 시스테인 잔기의 -SH가 산화된 기질의 disulfide에 전자를 주어 mixed disulfide가 형성되면, 두 번째 시스테인 잔기의 -SH가 전자를 제공하여 기질을 환원시키나, 두 번째 시스테인이 돌연변이 된 경우에는 mixed disulfide가 유지되어 기질을 잡아낼 수 있게 된다 (그림3).
그림3. The strategy for trapping TRP14 substrates based on its reaction mechanism

그림3. The strategy for trapping TRP14 substrates based on its reaction mechanism

이 방법을 이용하여 다수의 Trx1, Trx2, TRP14의 기질들을 확보하여 이들의 활성산소 표적 검증과 특정신호전달에서의 레독스 조절기전을 연구하고 있다. 예를 들면, TRP14의 기질로 탐색된 LC8이 환원된 상태에서는 IκBα에 결합하여 IKK에 의한 인산화와 그에 따른 분해를 억제하나, TNFα, IL-1β, LPS등의 자극에 의해 생성되는 활성산소에 의해 산화되면 IκBα에서 분리되어 IκBα가 인산화되고 분해되게 하며, TRP14는 LC8을 환원된 상태로 유지함으로써 NFκB의 레독스 조절에 관여함을 밝힌 바 있다 (그림4).
그림4. Redox regulation of NFκB by LC8, a redox-sensitive NFκB inhibitor

그림4. Redox regulation of NFκB by LC8, a redox-sensitive NFκB inhibitor

파골세포 분화의 레독스 조절기전 및 골다공증 치료제 개발 연구

우리 몸의 뼈(bone)는 일생동안 흡수(resorption)되고 다시 형성되는 역동적인 조직으로, 1년에 10% 정도가 골재형성(remodeling) 되는 것으로 알려져 있다. 이러한 연속적인 골재형성 과정에서 뼈를 형성하는 역할은 조골세포(osteoblast)가 뼈를 흡수하는 역할은 파골세포(osteoclast)가 담당하여 뼈의 항상성(bone homeostasis)을 유지하고 있다 (그림 5). 그러나 두 세포의 활성이 적절히 조절되지 못하면, 골다공증(osteoporosis)이나 골화석증(osteopetrosis)같은 골 관련 질환들이 발생된다. 골다공증은 노화가 진행됨에 따라 파골세포에 의한 골의 흡수량이 조골세포에 의한 골의 생성량보다 증가하면서 전체적인 골량 및 골밀도가 점진적으로 감소하게 됨으로써 골절이 발생하는 대사성 질환이며, 반대로 조골세포의 기능 과대는 골경화증을 일으킨다.

그림 5. Bone remodeling and bone homeostasis

그림 5. Bone remodeling and bone homeostasis

파골세포는 조혈모 세포(hematopoietic stem cell)에서 유래하는 monocyte lineage progenitor cells로부터 MCSF(macrophage colony stimulating factor) 존재 하에서 RANKL(receptor activator of NF-κB ligand)에 의해 분화된다. RANKL이 수용체(RANK)에 결합되면, TRAF6(TNF receptor-associated factor 6)를 통해 NF-κB와 MAPK가 활성화되고, c-Fos와 NFATc1 (nuclear factor of activated T cell, cytoplasmic 1)이 발현된다 (그림 6). NFATc1은 파골세포 분화와 골 흡수작용에서 매우 중요한 역학을 한다. 또한 파골세포 분화과정에서 활성산소가 생성되며, 활성산소는 파골세포 분화조절에 관여한다는 알려져 있다. RANKL에 의한 활성산소의 생성에는 TRAF6, Rac1, Nox1이 관여하며, 생성된 활성산소는 파골세포의 분화에 관여하는JNK나p38 같은MAPK의 활성을 조절한다는 것이 보고된 바 있다. 파골세포 분화의 레독스 조절에 관한 연구들은 주로 GSH나 N-acetyl cysteine (NAC)과 같은 항산화제나Nox 억제제인diphenylene iodonium (DPI)을 이용하여 RANKL에 의한 활성산소의 생성이 감소되고, 파골세포 분화와 관련된 MAPK나 NF-κB의 활성이 저해되어, 파골세포 분화가 억제됨을 보여줌으로써 파골세포 분화에 중요한 RANKL signaling에서 활성산소가 생성되고, 생성된 활성산소에 의해RANKL의 하위 신호전달과 파골세포 분화가 조절된다는 것을 제안하고는 있으나, 파골세포 분화의 레독스 조절기전을 이해하기 위해서는 활성산소 표적인자 및 레독스 조절효소의 파골세포 분화에서의 기능연구가 필요하다.
그림 6. Signal transduction and ROS generation during osteoclast differentiation

그림 6. Signal transduction and ROS generation during osteoclast differentiation

신호전달의 레독스 조절기전 연구에서 얻은 결과와 파골세포 분화에서 활성산소의 생성과 역할은 산화에 민감한 새로운 NFκB조절자인 LC8과 LC8의 레독스 조절자인 TRP14가 파골세포 분화 조절에 관여하리라는 것을 시사한다. 최근에 우리는 LC8이 산화환원 의존적 NFκB활성조절을 통해 파골세포 분화 조절에 관여하며, TRP14는 LC8 및 세포 내의 레독스를 조절하고 NFκB및 MAPK활성을 조절함으로써 파골세포 분화를 조절한다는 것을 보여 주었다 (그림 6). 또한 전사인자인 Nrf2도 여러 항산화효소의 발현을 통하여 세포 내 활성산소를 조절함으로써 파골세포 분화조절에 깊이 관여함을 보고 한바 있다 (그림 6). 현재는 과산화수소를 제거하는 퍼옥시레독신 6종 중 파골세포 분화조절에 관여하는 isoform을 선별하고 이에 대한 기전연구와, 독성이 적으면서 골 질환 치료에 이용할 수 있는 약물 개발을 위해 천연물로부터 파골세포 분화억제 효과가 있는 약물과 RANKL항체를 발굴하여 기전연구를 진행하고 있다.

활성산소를 매개로 한 항암기전 연구 및 항암제 개발 연구

활성산소는 양날의 칼로 작용한다. 적당한 양의 활성산소는 세포의 증식과 생존을 촉진하지만 세포의 활성산소 제거능력을 초과하는 과량의 활성산소는 세포사멸을 초래한다. 생리적인 조건에서 정상세포는 활성산소의 생성과 제거능력이 균형을 이루어 세포 내 활성산소를 낮은 수준으로 유지하고 있다. 정상세포는 외부 산화적 스트레스에 대하여 활성산소 제거능력(antioxidant capacity)을 증가시킴으로써 활성산소의 양을 세포사멸이 유도되지 않는 수준으로 유지한다. 암세포에서는 비정상적으로 증가된 대사와 암유발 신호전달에 의해 활성산소의 생성이 증가되어 있고, 이에 대한 산화환원 적응반응(redox adaptation response)으로 활성산소 제거능력도 증가되어 있다. 즉 암세포는 활성산소의 양을 세포사멸이 유도되지 않는 수준으로 유지하기 위하여 정상세포보다 훨씬 더 높은 수준으로 활성산소를 생성하고 제거하고 있으므로 외부 산화적 스트레스에 대하여 더 취약하고 항산화시스템(antioxidant system)에 더 의존적이다. 외부 산화적 스트레스에 대하여 정상세포는 항산화 시스템을 증가시켜 방어 작용을 할 수 있으나, 암세포는 증가된 활성산소에 의한 산화환원 적응반응으로 이미 항산화 시스템이 상당히 높은 수준으로 유지되고 있어 더 이상의 증가가 원활히 이루어지지 않아 정상세포에 비해 훨씬 더 많은 산화적 손상(oxidative damage)을 받아 세포사멸이 유발된다(그림 7).
그림 7. Cancer redox biology: a biological basis for therapeutic selectivity

그림 7. Cancer redox biology: a biological basis for therapeutic selectivity

이런 점을 기초로 하여 활성산소의 생성을 유도하거나 항산화 시스템을 저해하는 물질들을 암세포를 선택적으로 죽일 수 있는 항암제로 개발하기 위한 다양한 연구가 수행되고 있다. 예를 들어, 미토콘드리아 호흡 체인(respiratory chain)의 기능을 손상시켜 수퍼옥사이드(superoxide) 생성을 증가시키는 알세닉 트리옥사이드(arsenic trioxide, As2O3)는 미국 FDA 승인을 받아 세파론사(Cephalon)가 트리세녹스(Trisenox)라는 상품명으로 생산하여 백혈병 환자에 처방되고 있다. 또 다른 주요한 항산화 시스템인 Trx를 억제하는PX-12(1-methylpropyl 2-imidazolyl disulfide)도 강력한 종양억제 활성을 보이고, 수퍼옥사이드 디스무테이즈(superoxide dismutase)를 억제하는 2-메톡시에스트라디올(2-methoxyestradiol, 2-ME)은 전립선, 난소, 뇌, 신장암 등에 대하여 임상 2상 연구 진행 중이다.

 

비록 많은 경우 활성산소를 생성하는 물질이 효과를 보이지만, 낮은 임상적용과 내성이 보고되고 있다. 그러므로 항산화 시스템의 저해제가 좀 더 효과적인 항암제로 개발될 가능성이 높다. 항산화 효소들 중에서 퍼옥시레독신(peroxiredoxin, Prx)은 활성산소의 일종인 H2O2를 제거하는 퍼옥시데이즈(peroxidase)로서, 포유류에서 6종류의 퍼옥시레독신 아이소폼(Prx I-VI)이 발견되었고, 세포내 거의 모든 부분{세포질, 미토콘드리아, 핵, 퍼옥시즘(peroxisome), 소포체(endoplasmic reticulum)}에 존재한다. 퍼옥시레독신은 다양한 종류의 암 조직이나 세포에서 발현이 증가되어 있고, 항암제 개발을 위한 신규 표적으로 제시되고 있다. 퍼옥시레독신은 H2O2를 제거하는 촉매과정 중 일정 비율로 과산화되어 활성이 상실되고, 설피레독신(sulfiredoxin, Srx)에 의해 환원되어 활성이 다시 회복된다(그림 8). 설피레독신은 6종류의 퍼옥시레독신 아이소폼 중 4종류의 퍼옥시레독신(Prx I-Ⅳ)의 활성을 조절 할 수 있고, 여러 암 조직에서 설피레독신의 증가된 발현은 설피레독신이 항암제 개발의 신규표적 가능성을 시사한다.

그림 8. Trx 시스템에 의한 H2O2 제거, 과량의 H2O2에 의한 과산화 및 설피레독신에 의해 복구되는 2-Cys 퍼옥시다제 촉매 사이클

그림 8. Trx 시스템에 의한 H2O2 제거, 과량의 H2O2에 의한 과산화 및 설피레독신에 의해 복구되는 2-Cys 퍼옥시다제 촉매 사이클

설피레독신에 의한 과산화된 퍼옥시레독신의 환원반응 동안 ATP 가수분해가 일어나고, 반응에 넣어준 과산화된 퍼옥시레독신의 양만큼 무기인산(inorganic phosphate, "Pi")이 유리된다. 유리되는 무기인산(Pi)의 양을 측정함으로써 설피레독신 활성을 측정하는 대량탐색(HTS) 기법을 개발하고, 25,000개의 화합물 라이브러리로부터 설피레독신 저해활성을 보이는 hit 2종을 발견하였다. hit로부터 설피레독신 저해활성이 향상된 lead compound를 발굴하여, 인간 폐암 세포주인A549 세포에서 항암효과를 조사한 결과, 설피레독신 활성저해는 세포 내 활성산소의 축적을 유도하고, 세포 내 에너지 대사와 세포사멸기전에서 중요한 역할을 하는 미토콘드리아의 손상을 초래하여 세포가 사멸되며, 또한 정상세포 보다는 암세포에 특이적으로 활성산소 증가, 세포성장 억제, 미토콘드리아 손상 증가 및 세포사멸 증가 등을 유도하는 것으로 확인되었다. 현재 lead optimization과 다른 암세포 사멸기전에 대한 연구가 진행 중이다.

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